JavaScript er i øjeblikket deaktiveret i din browser.Når javascript er deaktiveret, vil nogle funktioner på denne hjemmeside ikke fungere.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonien, Spanien * Disse forfattere har nogle indsigter i dette værk Equal bidrag baggrund: Hyaluronsyre (HA) er et naturligt forekommende polysaccharid, der bruges til fremstilling af dermale fyldstoffer til æstetiske formål.Da det har en halveringstid på flere dage i menneskeligt væv, modificeres HA-baserede dermale fyldstoffer kemisk for at forlænge deres levetid i kroppen.Den mest almindelige modifikation i kommercielle HA-baserede fyldstoffer er brugen af 1,4-butandiol diglycidylether (BDDE) som et tværbindingsmiddel til at tværbinde HA-kæderne.Resterende eller ureageret BDDE anses for ikke-toksisk ved <2 dele pr. million (ppm);derfor skal den resterende BDDE i det endelige dermale fyldstof kvantificeres for at sikre patientsikkerheden.Materialer og metoder: Denne undersøgelse beskriver påvisning og karakterisering af et biprodukt af tværbindingsreaktionen mellem BDDE og HA under alkaliske forhold ved at kombinere væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS).Resultater: Efter forskellige analyser blev det fundet, at de alkaliske forhold og høje temperaturer, der blev brugt til at desinficere HA-BDDE-hydrogelen, fremmede dannelsen af dette nye biprodukt, den "propylenglycol-lignende" forbindelse.LC-MS-analyse bekræftede, at biproduktet har den samme monoisotopiske masse som BDDE, en anden retentionstid (tR) og en anden UV-absorbans (λ=200 nm) tilstand.I modsætning til BDDE blev det observeret i LC-MS-analyse, at under de samme målebetingelser har dette biprodukt en højere detektionshastighed ved 200 nm.Konklusion: Disse resultater indikerer, at der ikke er noget epoxid i strukturen af denne nye forbindelse.Diskussionen er åben for at vurdere risikoen ved dette nye biprodukt fundet i produktionen af HA-BDDE hydrogel (HA dermal filler) til kommercielle formål.Nøgleord: hyaluronsyre, HA dermal fyldstof, tværbundet hyaluronsyre, BDDE, LC-MS analyse, BDDE biprodukt.
Fyldstoffer baseret på hyaluronsyre (HA) er de mest almindelige og populære dermale fyldstoffer, der bruges til kosmetiske formål.1 Dette dermale fyldstof er en hydrogel, normalt sammensat af >95% vand og 0,5-3% HA, hvilket giver dem en gel-lignende struktur.2 HA er et polysaccharid og hovedbestanddelen af hvirveldyrs ekstracellulære matrix.En af ingredienserne.Den består af (1,4)-glucuronsyre-β (1,3)-N-acetylglucosamin (GlcNAc) gentagne disaccharidenheder forbundet med glykosidbindinger.Dette disaccharidmønster er det samme i alle organismer.Sammenlignet med nogle proteinbaserede fyldstoffer (såsom kollagen) gør denne egenskab HA til et yderst biokompatibelt molekyle.Disse fyldstoffer kan udvise aminosyresekvensspecificitet, som kan genkendes af patientens immunsystem.
Når det bruges som et dermalt fyldstof, er den største begrænsning af HA dets hurtige omsætning i vævene på grund af tilstedeværelsen af en specifik familie af enzymer kaldet hyaluronidaser.Hidtil er flere kemiske modifikationer i HA-strukturen blevet beskrevet for at øge halveringstiden af HA i væv.3 De fleste af disse modifikationer forsøger at reducere adgangen af hyaluronidase til polysaccharidpolymerer ved at tværbinde HA-kæder.Derfor, på grund af dannelsen af broer og de intermolekylære kovalente bindinger mellem HA-strukturen og tværbindingsmidlet, producerer den tværbundne HA-hydrogel flere anti-enzymnedbrydningsprodukter end den naturlige HA.4-6
Indtil videre omfatter de kemiske tværbindingsmidler, der er brugt til at fremstille tværbundet HA, methacrylamid, 7 hydrazid, 8 carbodiimid, 9 divinylsulfon, 1,4-butandiol diglycidylether (BDDE) og poly(ethylenglycol) diglycidylether.10,11 BDDE er i øjeblikket det mest almindeligt anvendte tværbindingsmiddel.Selvom disse typer hydrogeler har vist sig at være sikre i årtier, er de anvendte tværbindingsmidler reaktive reagenser, der kan være cytotoksiske og i nogle tilfælde mutagene.12 Derfor skal deres restindhold i den endelige hydrogel være højt.BDDE anses for at være sikkert, når restkoncentrationen er mindre end 2 dele per million (ppm).4
Der er flere metoder til at detektere lav-rest BDDE-koncentration, tværbindingsgrad og substitutionsposition i HA-hydrogeler, såsom gaskromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi koblet med massespektrometri (MS), nuklear magnetisk resonans (NMR) fluorescensmålingsmetoder og Diode array-koblet højtydende væskekromatografi (HPLC).13-17 Denne undersøgelse beskriver påvisning og karakterisering af et biprodukt i den endelige tværbundne HA-hydrogel fremstillet ved reaktionen af BDDE og HA under alkaliske betingelser.HPLC og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS analyse).Da toksiciteten af dette biprodukt af BDDE er ukendt, anbefaler vi, at dets restkvantificering bestemmes på samme måde som den metode, der normalt udføres på BDDE i slutproduktet.
Det opnåede natriumsalt af HA (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) har en molekylvægt på ~1.368.000 Da (Laurent-metoden) 18 og en indre viskositet på 2,20 m3/kg.Til tværbindingsreaktionen blev BDDE (≥95%) købt fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Phosphatbufret saltvand med pH 7,4 blev købt fra Sigma-Aldrich Company.Alle opløsningsmidler, acetonitril og vand anvendt i LC-MS-analysen blev købt fra HPLC-kvalitet.Myresyre (98%) købes som reagenskvalitet.
Alle eksperimenter blev udført på et UPLC Acquity-system (Waters, Milford, MA, USA) og forbundet til et API 3000 tredobbelt kvadrupol massespektrometer udstyret med en elektrospray-ioniseringskilde (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Syntesen af tværbundne HA-hydrogeler blev startet ved at tilsætte 198 mg BDDE til en 10 % (vægt/vægt) opløsning af natriumhyaluronat (NaHA) i nærværelse af 1 % alkali (natriumhydroxid, NaOH).Den endelige BDDE-koncentration i reaktionsblandingen var 9,9 mg/ml (0,049 mM).Derefter blev reaktionsblandingen grundigt blandet og homogeniseret og fik lov til at fortsætte ved 45°C i 4 timer.19 Reaktionens pH holdes på ~12.
Derefter blev reaktionsblandingen vasket med vand, og den endelige HA-BDDE-hydrogel blev filtreret og fortyndet med PBS-buffer for at opnå en HA-koncentration på 10 til 25 mg/ml og en endelig pH-værdi på 7,4.For at sterilisere de producerede tværbundne HA-hydrogeler autoklaveres alle disse hydrogeler (120°C i 20 minutter).Den oprensede BDDE-HA-hydrogel opbevares ved 4°C indtil analyse.
For at analysere BDDE i det tværbundne HA-produkt blev en 240 mg prøve vejet og indført i centerhullet (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volumen 0,5 ml) og centrifugeret ved 10.000 rpm ved stuetemperatur 10 minutter.I alt 20 µL pull-down væske blev opsamlet og analyseret.
For at analysere BDDE-standarden (Sigma-Aldrich Co) under alkaliske forhold (1%, 0,1% og 0,01% NaOH), hvis følgende betingelser er opfyldt, er væskeprøven 1:10, 1:100 eller op til 1:1.000.000 Brug om nødvendigt MilliQ deioniseret vand til analyse.
For udgangsmaterialerne anvendt i tværbindingsreaktionen (HA 2%, H2O, 1% NaOH og 0,049 mM BDDE), blev 1 ml af hver prøve fremstillet af disse materialer analyseret under anvendelse af de samme analysebetingelser.
For at bestemme specificiteten af de toppe, der vises i ionkortet, blev 10 µL 100 ppb BDDE-standardopløsning (Sigma-Aldrich Co) tilsat til 20 µL prøven.I dette tilfælde er den endelige koncentration af standarden i hver prøve 37 ppb.
Forbered først en BDDE-stamopløsning med en koncentration på 11.000 mg/L (11.000 ppm) ved at fortynde 10 μL standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) med 990 μL MilliQ-vand (densitet 1,1 g/mL).Brug denne opløsning til at fremstille en 110 µg/L (110 ppb) BDDE-opløsning som en mellemliggende standardfortynding.Brug derefter den mellemliggende BDDE-standardfortynder (110 ppb) til at forberede standardkurven ved at fortynde den mellemliggende fortynder flere gange for at opnå den ønskede koncentration på 75, 50, 25, 10 og 1 ppb.Som vist i figur 1 viser det sig, at BDDE-standardkurven fra 1,1 til 110 ppb har god linearitet (R2>0,99).Standardkurven blev gentaget i fire uafhængige eksperimenter.
Figur 1 BDDE standard kalibreringskurve opnået ved LC-MS analyse, hvor en god korrelation observeres (R2>0,99).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri.
For at identificere og kvantificere de BDDE-standarder, der er til stede i den tværbundne HA og BDDE-standarderne i basisopløsningen, blev der anvendt LC-MS-analyse.
Den kromatografiske adskillelse blev opnået på en LUNA 2,5 µm C18(2)-HST-søjle (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) og holdt ved stuetemperatur (25°C) under analysen.Den mobile fase består af acetonitril (opløsningsmiddel A) og vand (opløsningsmiddel B) indeholdende 0,1 % myresyre.Den mobile fase elueres ved gradienteluering.Gradienten er som følger: 0 minutter, 2% A;1 minut, 2% A;6 minutter, 98% A;7 minutter, 98% A;7,1 minutter, 2% A;10 minutter, 2% A. Køretiden er 10 minutter, og injektionsvolumenet er 20 µL.Retentionstiden for BDDE er ca. 3,48 minutter (spænder fra 3,43 til 4,14 minutter baseret på eksperimenter).Den mobile fase blev pumpet med en strømningshastighed på 0,25 ml/min til LC-MS-analyse.
Til BDDE-analyse og kvantificering af MS er UPLC-systemet (Waters) kombineret med et API 3000 triple quadrupole massespektrometer (AB SCIEX) udstyret med en elektrospray-ioniseringskilde, og analysen udføres i positiv ion-tilstand (ESI+).
Ifølge ionfragmentanalysen udført på BDDE blev fragmentet med den højeste intensitet bestemt til at være fragmentet svarende til 129,1 Da (figur 6).Derfor, i multi-ion overvågningstilstanden (MIM) til kvantificering, er masseomdannelsen (masse-til-ladningsforhold [m/z]) af BDDE 203,3/129,1 Da.Den bruger også fuld scanningstilstand (FS) og produktionscanningstilstand (PIS) til LC-MS-analyse.
For at verificere metodens specificitet blev en blindprøve (initial mobil fase) analyseret.Der blev ikke påvist noget signal i blindprøven med en masseomdannelse på 203,3/129,1 Da.Med hensyn til eksperimentets repeterbarhed blev 10 standardinjektioner på 55 ppb (midt på kalibreringskurven) analyseret, hvilket resulterede i en resterende standardafvigelse (RSD) <5 % (data ikke vist).
Det resterende BDDE-indhold blev kvantificeret i otte forskellige autoklaverede BDDE-tværbundne HA-hydrogeler, svarende til fire uafhængige eksperimenter.Som beskrevet i afsnittet "Materialer og metoder" evalueres kvantificeringen ud fra gennemsnitsværdien af regressionskurven for BDDE-standardfortyndingen, som svarer til den unikke top detekteret ved BDDE-masseovergangen på 203,3/129,1 Da, med en retention tid på 3,43 til 4,14 minutter Venter ikke.Figur 2 viser et eksempel på et kromatogram af 10 ppb BDDE-referencestandarden.Tabel 1 opsummerer det resterende BDDE-indhold i otte forskellige hydrogeler.Værdiområdet er 1 til 2,46 ppb.Derfor er den resterende BDDE-koncentration i prøven acceptabel til human brug (<2 ppm).
Figur 2 Ionchromatogram af 10 ppb BDDE-referencestandard (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) overgang opnået ved LC-MS-analyse af 203.30/129.10 Da (i positiv MRM-tilstand).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning;MS, masse;m/z, masse-til-ladning-forhold.
Bemærk: Prøver 1-8 er autoklaverede BDDE-tværbundne HA-hydrogeler.Den resterende mængde af BDDE i hydrogelen og toppen af BDDE-retentionstiden er også rapporteret.Endelig rapporteres der også om eksistensen af nye toppe med forskellige retentionstider.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;HA, hyaluronsyre;MRM, multipel reaktionsovervågning;tR, retentionstid;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;RRT, relativ retentionstid.
Overraskende nok viste analysen af LC-MS-ionkromatogrammet, at baseret på alle de autoklaverede tværbundne HA-hydrogelprøver, der blev analyseret, var der en ekstra top ved den kortere retentionstid på 2,73 til 3,29 minutter.For eksempel viser figur 3 ion-kromatogrammet af en tværbundet HA-prøve, hvor en yderligere top vises ved en anden retentionstid på ca. 2,71 minutter.Den observerede relative retentionstid (RRT) mellem den nyligt observerede top og toppen fra BDDE viste sig at være 0,79 (tabel 1).Da vi ved, at den nyligt observerede top er mindre tilbageholdt i C18-søjlen brugt i LC-MS-analysen, kan den nye top svare til en mere polær forbindelse end BDDE.
Figur 3 Ionkromatogram af tværbundet HA-hydrogelprøve opnået ved LC-MS (MRM-masseomdannelse 203,3/129,0 Da).
Forkortelser: HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning;RRT, relativ retentionstid;tR, retentionstid.
For at udelukke muligheden for, at de nye observerede toppe kan være forurenende stoffer, der oprindeligt var til stede i de anvendte råvarer, blev disse råmaterialer også analyseret med samme LC-MS analysemetode.De analyserede udgangsmaterialer inkluderer vand, 2% NaHA i vand, 1% NaOH i vand og BDDE i samme koncentration som anvendt i tværbindingsreaktionen.Ionchromatogrammet af det anvendte udgangsmateriale viste ingen forbindelse eller top, og dets retentionstid svarer til den nye observerede top.Denne kendsgerning forkaster ideen om, at ikke kun udgangsmaterialet kan indeholde forbindelser eller stoffer, der kan interferere med analyseproceduren, men der er ingen tegn på mulig krydskontaminering med andre laboratorieprodukter.Koncentrationsværdierne opnået efter LC-MS-analyse af BDDE og nye toppe er vist i tabel 2 (prøve 1-4) og ionkromatogrammet i figur 4.
Bemærk: Prøver 1-4 svarer til de råmaterialer, der bruges til at fremstille autoklaverede BDDE-tværbundne HA-hydrogeler.Disse prøver blev ikke autoklaveret.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning.
Figur 4 svarer til LC-MS-kromatogrammet af en prøve af råmaterialet, der anvendes i tværbindingsreaktionen af HA og BDDE.
Bemærk: Alle disse måles ved den samme koncentration og det samme forhold, som bruges til at udføre tværbindingsreaktionen.Tallene for råmaterialerne analyseret med kromatogrammet svarer til: (1) vand, (2) 2% HA vandig opløsning, (3) 1% NaOH vandig opløsning.LC-MS-analyse udføres for masseomdannelse på 203,30/129,10 Da (i positiv MRM-tilstand).
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;HA, hyaluronsyre;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning.
De forhold, der førte til dannelsen af nye toppe, blev undersøgt.For at studere, hvordan de reaktionsbetingelser, der bruges til at fremstille den tværbundne HA-hydrogel, påvirker reaktiviteten af BDDE-tværbindingsmidlet, hvilket fører til dannelsen af nye toppe (mulige biprodukter), blev der udført forskellige målinger.I disse bestemmelser studerede og analyserede vi den endelige BDDE tværbinder, som blev behandlet med forskellige koncentrationer af NaOH (0%, 1%, 0,1% og 0,01%) i et vandigt medium, efterfulgt af eller uden autoklavering.Bakterieproceduren til at simulere de samme forhold er den samme som metoden, der anvendes til at fremstille den tværbundne HA-hydrogel.Som beskrevet i afsnittet "Materialer og metoder" blev masseovergangen af prøven analyseret af LC-MS til 203.30/129.10 Da.BDDE og koncentrationen af den nye top beregnes, og resultaterne er vist i tabel 3. Der blev ikke påvist nye toppe i prøverne, der ikke var autoklaveret, uanset tilstedeværelsen af NaOH i opløsningen (prøve 1-4, tabel 3).For autoklaverede prøver detekteres nye toppe kun ved tilstedeværelse af NaOH i opløsningen, og dannelsen af toppen ser ud til at afhænge af NaOH-koncentrationen i opløsningen (prøve 5-8, tabel 3) (RRT = 0,79).Figur 5 viser et eksempel på et ionkromatogram, der viser to autoklaverede prøver i nærvær eller fravær af NAOH.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning.
Bemærk: Det øverste kromatogram: Prøven blev behandlet med 0,1% NaOH vandig opløsning og autoklaveret (120°C i 20 minutter).Bundkromatogram: Prøven blev ikke behandlet med NaOH, men autoklaveret under de samme betingelser.Masseomdannelsen på 203,30/129,10 Da (i positiv MRM-tilstand) blev analyseret ved LC-MS.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning.
I alle autoklaverede prøver, med eller uden NaOH, var BDDE-koncentrationen stærkt reduceret (op til 16,6 gange) (prøve 5-8, tabel 2).Faldet i BDDE-koncentrationen kan skyldes, at vand ved høje temperaturer kan fungere som en base (nukleofil) for at åbne epoxidringen af BDDE og danne en 1,2-diolforbindelse.Den monoisotopiske kvalitet af denne forbindelse er forskellig fra den af BDDE og vil derfor ikke blive påvirket.LC-MS detekterede et masseskift på 203.30/129.10 Da.
Endelig viser disse eksperimenter, at genereringen af nye toppe afhænger af tilstedeværelsen af BDDE, NAOH og autoklaveringsprocessen, men har intet at gøre med HA.
Den nye top fundet ved en retentionstid på ca. 2,71 minutter blev derefter karakteriseret ved LC-MS.Til dette formål blev BDDE (9,9 mg/ml) inkuberet i en 1% vandig NaOH-opløsning og autoklaveret.I tabel 4 er karakteristikaene for den nye top sammenlignet med den kendte BDDE-referencetop (retentionstid ca. 3,47 minutter).Baseret på ionfragmenteringsanalysen af de to toppe kan det konkluderes, at toppen med en retentionstid på 2,72 minutter viser de samme fragmenter som BDDE-toppen, men med forskellige intensiteter (figur 6).For toppen svarende til retentionstiden (PIS) på 2,72 minutter blev der observeret en mere intens top efter fragmentering ved en masse på 147 Da.Ved BDDE-koncentrationen (9,9 mg/ml) anvendt i denne bestemmelse blev forskellige absorbanstilstande (UV, λ=200 nm) i det ultraviolette spektrum også observeret efter kromatografisk adskillelse (figur 7).Toppen med en retentionstid på 2,71 minutter er stadig synlig ved 200 nm, mens BDDE-toppen ikke kan observeres i kromatogrammet under samme betingelser.
Tabel 4 Karakteriseringsresultater af den nye top med en retentionstid på ca. 2,71 minutter og BDDE-toppen med en retentionstid på 3,47 minutter
Bemærk: For at opnå disse resultater blev LC-MS og HPLC analyser (MRM og PIS) udført på de to toppe.Til HPLC-analyse anvendes UV-detektion med en bølgelængde på 200 nm.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;HPLC, højtydende væskekromatografi;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning;m/z, masse-til-ladning-forhold;PIS, produkt Ion scanning;ultraviolet lys, ultraviolet lys.
Bemærk: Massefragmenterne opnås ved LC-MS-analyse (PIS).Topkromatogram: massespektrum af BDDE-standardprøvefragmenter.Bundkromatogram: Massespektret for den nye detekterede top (RRT forbundet med BDDE-toppen er 0,79).BDDE blev behandlet i 1 % NaOH-opløsning og autoklaveret.
Forkortelser: BDDE, 1,4-butandiol diglycidylether;LC-MS, væskekromatografi og massespektrometri;MRM, multipel reaktionsovervågning;PIS, produkt ion scanning;RRT, relativ retentionstid.
Figur 7 Ionkromatogram af 203.30 Da-precursorionen og (A) den nye top med en retentionstid på 2.71 minutter og (B) UV-detektionen af BDDE-referencestandardtoppen ved 3.46 minutter ved 200 nm.
I alle de fremstillede tværbundne HA-hydrogeler blev det observeret, at den resterende BDDE-koncentration efter LC-MS-kvantificering var <2 ppm, men en ny ukendt top viste sig i analysen.Denne nye top matcher ikke BDDE-standardproduktet.BDDE-standardproduktet har også gennemgået den samme kvalitetskonvertering (MRM-konvertering 203.30/129.10 Da) analyse i positiv MRM-tilstand.Generelt bruges andre analytiske metoder såsom kromatografi som grænsetest til at påvise BDDE i hydrogeler, men den maksimale detektionsgrænse (LOD) er lidt lavere end 2 ppm.På den anden side er NMR og MS hidtil blevet brugt til at karakterisere graden af tværbinding og/eller modifikation af HA i sukkerenhedsfragmenterne af tværbundne HA-produkter.Formålet med disse teknikker har aldrig været at kvantificere resterende BDDE-detektion ved så lave koncentrationer, som vi beskriver i denne artikel (LOD af vores LC-MS-metode = 10 ppb).
Posttid: 01-09-2021